Pendahuluan Sistem diagnostik DNA

Konsep umum

Materi genetik dari suatu organisme mengandung informasi esensial yang menyumbangkan berbagai fitur dan karakteristik organisme tersebut. Sebagai contoh, patogenitas bakteri bisa jadi karena kehadiran dari gen spesifik atau sekelompok gen. Sama seperti itu, alterasi dari gen bisa menyebabkan penyakit yang diturunkan pada manusia. Dalam teori, sekuens nukleotida yang berkontribusi pada karakteristik biologis tertentu adalah sidik jari tertentu yang unik, bila dapat dideteksi bisa digunakan sebagai penentu diagnostik yang definit.

Hibridisasi asam nukleat adalah dasar untuk esei yang cepat dan terpercaya. Basis fisis dari sistem ini adalah pemasangan basa nukleotida yang tepat dan ikatan hidrogen antara satu string dari nukleotida dan sekuens nukleotida komplemennya. Skema hibridisasi asam nukleat pada laboratorium secara umum adalah sebagai berikut:

1. Ikat DNA untai tunggal (target) pada membran pendukung.
2. Tambahkan DNA untai tunggal berlabel (probe) pada kondisi yang cocok dari temperatur dan kekuatan ionik untuk mempromosikan pemasangan basa antara probe dan DNA target.
3. Cuci dukungan untuk menghilangkan probe DNA berlebih yang tidak terikat.
4. Deteksi sekuens hibrid yang terbentuk antara probe dan DNA target.
5. Test diagnostik hibridisasi asam nukleat memiliki tiga elemen kritis: DNA probe, DNA target, dan deteksi signal. Tipe sistem deteksi ini dapat menjadi sangat spesifik atau sangat sensitif.

Probe Hibridisasi

Untuk menjadi efektif, probe hibridisasi asam nukleat harus memiliki spesifitas yang sangat tinggi. Dengan kata lain, probe harus hibridisasi secara eksklusif pada sekuens asam nukleat target yang dipilih. Positif palsu (i.e., respon pada ketidakhadiran sekuens target) dan negatif palsu mengganggu kegunaan dari prosedur diagnostik. Probe dapat menjadi spesifik pada berbagai tingkat organismik. Mereka dapat membedakan antara dua atau lebih spesies, menentukan strain tertentu dalam suatu spesies, atau mengidentifikasi perbedaan antara gen. Bergantung pada keperluan dari protokol test, probe bisa DNA atau RNA; panjang (>100 nukleotida) atau pendek (<50 nukleotida); disintesa secara kimia, mengklon gen yang utuh, atau mengisolasi daerah tertentu dari gen.

Sekuens yang dapat membuat probe efektif dapat diisolasi dalam berbagai cara. Sebagai contoh, DNA dari organisme patogen dapat dipotong dengan restriksi endonuklease dan diklon ke vektor plasmid. Plasmid rekombinan ditapiskan dengan DNA genomik dari strain yang patogen dan non-patogen. Plasmid-plasmid tersebut yang mengandung sekuens yang berhibridisasi hanya pada strain patogen dari dasar probe spesifik. Test hibridisasi tambahan dengan DNA dari berbagai rentang organisme selanjutnya dilakukan untuk meyakinkan bahwa sekuens probe kandidat tidak melakukan hibridisasi silang. Setiap probe potensial juga diuji dalam kondisi sampel yang disimulasi. Kondisi sampel, termasuk kehadiran dari kultur campuran, untuk menentukan tingkat sensitivitasnya.

Kemampuan untuk melakukan esei diagnostik probe asam nukleat secara langsung pada sampel yang ada tanpa kultur tambahan atau prosedur ekstraksi yang membuang waktu adalah sangat diinginkan, terutama dengan spesimen klinis. Peneliti telah berhasil menggunakan probe yang berhibridisasi dengan DNA target dari sampel feses, urin, darah, kumur, dan sampel jaringan, tanpa purifikasi DNA yang ekstensif. Jika sekuens target adalah jarang pada sampel kerja, PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasinya.

Prosedur Hibridisasi Nonradioaktif

Dalam mayoritasi laboratorium riset, hibridisasi asam nukleat dideteksi secara rutin dengan melabel probe dengan isotop radioaktif, umumnya fosfor-32. Aktivitas spesifik yang tinggi menjamin rasion signal ke suara yang bagus. Dalam sistem deteksi standar, probe radioaktif dicampur dengan DNA target yang terikat pada membran pendukung. Setelah pencucian, pendukung bebas dari DNA probe yang tak terhibridisasi, kehadiran dari radioaktif ditentukan dengan meletakkan membran pada film sinar-X (autoradiografi).

Bagaimanapun, fosfor-32 waktu hidupnya pendek, berpotensi bahaya, dan memerlukan peralatan laboratorium spesial untuk pembuangan dan penanganan yang aman, maka sistem nonradioaktif untuk pembentukan signal DNA hibrid juga dikembangkan. Sistem deteksi nonradioaktif mencapai amplifikasi signal dengan konversi enzimatis dari substrat kromogenik dan kemiluminesen. Substrat kromogenik mengubah warna dan substrat kemiluminesen mematikan lampu ketika mereka dikonversi menjadi produk spesifik oleh enzim yang cocok. Signal dideteksi, dikebanyakan sistem, dengan menggabungkan nukleotida yang dilabel biotin ke probe DNA.

Daftar Pustaka

1. Glick dan Pasternak. Molecular Biotechnology. ASM Press. 1990.
2. Maria Odete et al. Detection of Human Papillomavirus DNA by the Hybrid Capture Assay. The Brazillian Journal of Infectious Diseases. Hal 121-125. 2003.

Kredit Gambar:

http://www.3dscience.com/img/Products/3D_Models/Biology/DNA/DNA_w_Phosphate_structure/Supporting_images/

Kata Pencarian Artikel ini: